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中華國際癌病康復協會期刊 漢方與生活

內容
中草藥複方毒殺癌細胞作用研究(青杏2號)
中草藥複方刺激腫瘤細胞株K562、U937、MT-2、CT26/RT1細胞毒殺作用研究
 
一、前言             
      
      (一)  研究背景
        
        口腔扁平苔蘚(OLP) 如同前次實驗研究的復發性口瘡潰瘍（RAU）一樣，是常見的口腔黏膜疾病之一，口腔扁平苔蘚(OLP)發病病因目前尚不明確，但近幾年的研究顯示，免疫反應可能扮演重要角色。我們之前的研究證明在OLP病患中，其抗鹼性球抗體量明顯比正常人高，由於OLP病患血清中抗鹼性球抗體的存在且至少能持續數月或數年之久，我們推測OLP可能為一種自體免疫疾病。
        抗核抗體（ANA）和抗平滑肌抗體（SMA）屬於自體免疫抗體，在臨床上診斷自體免疫疾病常用的項目，研究顯示，在非器官專一性的自體免疫疾病中病患血清內的ANA和SMA量較正常值高，最近的研究發現，OLP病患的血清中ANA陽性檢測率較正常人高，特別是糜爛性口腔扁平苔癬（EOLP）病患，此外，OLP、RAU或口腔鱗狀細胞癌病患血清SMA量也顯著的高於健康的人。進一步的研究顯示，免疫調節劑levamisole和中藥可調節惡性EOLP病患血清中口腔鱗狀細胞癌抗原（SCCA）的量。
 
      (二)  免疫簡介
       
        免疫系統傳統的區分為非特異性及特異性免疫，當外來的病原菌或其他危害因子入侵人體時，不同的免疫反應扮演不同的角色功能來預防抵抗之，非特異性免疫反應是人體抵抗外來病原菌，例如細菌或病毒，的第一道防線，其中免疫系統中的自然殺手細胞扮演極其重要的角色，自然殺手細胞是保護人體免於癌症侵害的第一道防線。
        體內細胞免疫性T細胞需要經過抗原抗體反應才能殺死癌細胞，而自然殺手細胞只需要辨識出腫瘤細胞表面的異常因子，即可立即以細胞毒殺作用將癌細胞清除，作用時間只要幾分鐘。因此，自然殺手細胞的毒殺活性是人類抗癌力最初步也是最重要的指標之一。而成熟的自然殺手細胞存在於人類的末梢血液、骨髓及脾臟當中，但在淋巴結及胸腺中含量極少，它是屬於淋巴球的一種，佔末梢血液淋巴球中的10％至15％。自然殺手細胞可以直接攻擊被病毒感染的細胞，甚至是病變的癌細胞，而不需要特別的辯識工作，更特別的是，自然殺手細胞根本不需知道抗原的性質，便可立刻施以攻擊，由此可知，自然殺手細胞之攻擊力是比T細胞高出許多。
       
      (三)  實驗目的
       
        由於RAU和OLP病患為細胞性和體液性免疫失調所造成的口腔黏膜疾病，且OLP有可能轉型為惡性口腔癌，因此本研究目的為測試中草藥複方對各種腫瘤細胞株的細胞毒殺作用。
 
      (四)  實驗說明
       
        我們除了以中草藥複方直接作用於K562細胞外，還直接作用於其他癌細胞株U937、MT-2、CT26/RT1，並且以TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling（TUNEL）作免疫染色，TUNEL是一種用來檢測細胞凋亡(apoptosis)的分析方法。細胞凋亡有一項重要的特徵為細胞內的DNA會碎裂成片段，TUNEL可以有效的去探測DNA片段的產生，所以可以傳達細胞凋亡的訊息。
其好處是可以在細胞凋亡發生的早期，即可偵測到DNA片段的產生，並且可以直接使用在組織切片上，觀察細胞凋亡發生的位置。所以TUNEL目前為廣泛接受與使用的一種細胞凋亡的分析方法。
        本研究中，藉由從復發性口瘡潰瘍（RAU）和糜爛性口腔扁平苔癬（EOLP）病人分離出的周邊血液單核球（PBMC）來檢測中草藥複方和活性化多醣體集合化合物（AHCC）是否可刺激腫瘤細胞株K562或MT-2細胞毒殺作用，此外，CD4+和CD8+細胞參與PBMC所媒介的K562或MT-2細胞毒殺作用的角色，亦藉由CD4+或CD8+T細胞去除的PBMC來檢測K562或MT-2細胞溶解作用
 
二、結果
       
        結果發現，當沒有刺激物加入時，從RAU病患分離出來的完整PBMC、CD4+或CD8+T細胞去除的PBMC，在T-細胞拹助的細胞性免疫反應下，皆會毒殺K562。
      當不同稀釋濃度的中草藥複方加入從RAU病患分離出來的完整PBMC中時，PBMC毒殺K562細胞的作用隨著濃度增加而增加，其中當中草藥複方以稀釋倍數1:100的比率加入完整PBMC、CD4+或CD8+T細胞去除的PBMC時，K562的細胞溶解作用有顯著的增加。
 
        更進一步的研究顯示，是CD8+T細胞參與中草藥複方所刺激的K562細胞毒殺作用而非CD4+ T細胞。此外，加入活性化多醣體集合化合物（AHCC, 5 μg/ml）至從RAU病患分離出來的PBMC中，在T-細胞拹助的細胞性免疫反應下，亦可顯著的增加K562的細胞溶解作用（表一），其中CD4+和CD8+T細胞皆參與AHCC活化的K562細胞毒殺作用
 
 

RAU病患

　

%專一性毒殺作用(mean±SD)

 

 

協助細胞 / 標的細胞 比例

 

病例數

     25

    10

     5

完整PBMC

     5

13.2±5.6

7.6±4.4

5.6±2.7

CD4+T細胞去除的PBMC

     6

11.7±10.6

7.3±7.2

5.3±5.8

CD8+T細胞去除的PBMC

     4

3.8±3.0

2.9±1.5

2.3±1.5

 

 

 

 

 

完整PBMC+中草藥複方(1/100)

     5

41.2±13.6

45.4±13.2

47.8±14.1

CD4+T細胞去除的PBMC+中草藥複方(1/100)

     6

32.0±8.2

34.0±8.2

31.0±2.7

CD8+T細胞去除的PBMC+中草藥複方(1/100)

     4

22.8±4.2

22.5±8.5

25.5±8.2

 

 

 

 

 

完整PBMC+AHCC(5μg/ml)

     5

27.0±9.9

17.5±9.2

13.0±5.7

CD4+T細胞去除的PBMC+AHCC(5μg/ml)

     6

12.7±4.0

5.3±1.2

2.0±1.0

CD8+T細胞去除的PBMC+AHCC(5μg/ml)

     4

6.0±5.6

4.7±4.1

2.7±1.2

 
表一：在中草藥複方或AHCC存在與否的條件下，從RAU病患分離出來的完整PBMC、CD4+或CD8+T細胞去除的PBMC毒殺K562的效果。
 
         當沒有刺激物加入時，在T-細胞拹助的細胞性免疫反應下，從EOLP病患分離出來的完整PBMC、CD4+或CD8+T細胞去除的PBMC皆會毒殺K562。
       其中當中草藥複方以稀釋倍數1:100的比率加入完整PBMC、CD4+或CD8+T細胞去除的PBMC時，K562的細胞溶解作用有顯著的增加，相反的，加入活性化多醣體集合化合物（AHCC, 5 μg/ml）至從EOLP病患分離出來的PBMC中，並不會顯著的增加K562的細胞溶解作用（表二），此外，CD4+和CD8+T細胞皆不參與PBMC媒介的K562細胞毒殺作用，無論中草藥複方或AHCC加入與否。
 

EOLP病患

　

%專一性毒殺作用(mean±SD)

 

 

協助細胞 / 標的細胞 比例

　

病例數

     25

    10

     5

完整PBMC

     6

14.2±7.3

8.5±4.6

7.0±5.2

CD4+T細胞去除的PBMC

     4

11.0±6.1

5.5±5.9

4.0±6.2

CD8+T細胞去除的PBMC

     5

16.6±8.1

14.0±2.9

10.3±7.4

 

 

 

 

 

完整PBMC+中草藥複方(1/100)

     6

37.2±10.7

42.0±10.3

41.2±8.4

CD4+T細胞去除的PBMC+中草藥複方(1/100)

     4

27.5±4.8

28.0±4.6

31.8±4.4

CD8+T細胞去除的PBMC+中草藥複方(1/100)

     5

31.2±3.1

40.0±9.9

37.0±6.8

 

 

 

 

 

完整PBMC+AHCC(5μg/ml)

     6

18.4±6.7

13.2±6.4

8.3±5.8

CD4+T細胞去除的PBMC+AHCC(5μg/ml)

     4

16.3±4.6

10.3±8.3

9.3±7.4

CD8+T細胞去除的PBMC+AHCC(5μg/ml)

     5

17.0±6.3

13.4±5.9

6.6±4.2

 
表二：在中草藥複方或AHCC存在與否的條件下，從EOLP病患分離出來的完整PBMC、CD4+或CD8+T細胞去除的PBMC毒殺K562的效果。
 
        無論從RAU或EOLP病患分離出來的CD8+T細胞皆不會毒殺K562細胞或僅僅有標準底線的毒殺反應。但是若加入中草藥複方（1:100）或植物分裂原（PHA, 1 μg/ml）於從RAU或EOLP病患分離出來的CD8+T細胞，可顯著的增加毒殺K562細胞的能力。
        此外，從RAU病患分離出來的完整PBMC，在T-細胞拹助的細胞性免疫反應下，毒殺MT-2細胞，其中當中草藥複方以稀釋倍數1:100的比率加入從RAU病患分離出來的PBMC時，MT-2的細胞溶解作用有顯著的增加，相反的，加入活性化多醣體集合化合物（AHCC, 5 μg/ml）則無顯著的增加效果。
      中草藥複方可直接殺死K562、U937、MT-2、CT26/RT1之腫瘤細胞，以TUNEL進一步測試顯示，中草藥複方對K562和U937有癌細胞凋亡作用，但不傷害正常之臍帶內皮細胞，而AHCC則無直接殺死腫瘤細胞的能力。
 
三、結論
  1. 以稀釋倍數1:100比率的中草藥複方加入從RAU或EOLP病患分離出來的PBMC或CD8+T細胞中，可顯著的增加K562細胞毒殺作用。
  2. 中草藥複方可直接殺死K562、U937、MT-2、CT26/RT1之腫瘤細胞，以TUNEL進一步測試顯示，中草藥複方對K562和U937有癌細胞凋亡作用，不但不傷害正常之臍帶內皮細胞，還能有效活化正常臍帶之內皮細胞。
  3. 中草藥複方所包含的成分可能活化自然殺手細胞（NK cell）來毒殺K562細胞，並直接誘導K562、U937腫瘤細胞趨向凋亡。 
發佈時間：2007-05-08 02:05:38
資料來源：中日飛達聯合有限公司